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高效液相(HPLC)色谱柱五大误解

发布时间:2022-07-26      点击次数:457


使用填充较小颗粒的色谱柱,总能获得更高的效率


假。尽管对于填充良好的色谱柱,随着填充色谱柱中颗粒平均直径的减小,效率会提高,但如果柱外对特定HPLC硬件系统的谱带扩宽的贡献足够高,则该色谱柱的全部性能将无法获得被实现。柱外成分包括填料本身以外的所有其他体积。这些贡献包括以下内容:
  • 进样量包括回路尺寸以及进样阀内的其他体积。

  • 从进样器出口到色谱柱入口的油管容积。

  • 保护柱间隙的体积,包括端接头(如果有)。

  • 在线过滤器体积(如果有)。

  • 入口色谱柱接头内的内部容积包括多孔筛板和流动通道。

  • 色谱柱的体积。

  • 底部色谱柱接头内的内部容积包括多孔筛板和流动通道。

  • 从色谱柱出口到检测器入口的油管容积。

  • 流通池之前的检测器内的管道容积。

  • 流通池体积。

所有这些体积的方差都是累加的。因此,可以程度地减少进样量并使色谱柱入口管的长度短,内径小,但如果从色谱柱出口到检测器的连接管有1 m,则谱带展宽可能足够大影响分离的整体效率。因此,如果您希望获得1.8 μm HPLC色谱柱或内径为1.0 mm的色谱柱的预期效率,请确保将柱外效应降至低。


误解2

对于硅胶填料,残留的硅烷醇导致拖尾峰

假。在某些情况下,存在于所有基于硅胶的键合相色谱柱上的硅烷醇会引起拖尾,特别是对于碱性化合物而言。这种拖尾归因于硅烷醇基团是一种弱酸,pKa约为4.5-4.7。因此,当流动相的pH值接近4-5时,硅烷醇被离子化,并可以通过静电吸引作用与带正电的分子(如质子化的胺)相互作用。通过将pH值降至3以下来抑制硅烷醇的离子化,可以大程度地减少这种相互作用。对于某些碱性化合物,有时在较低的pH值下会出现拖尾现象。有专门设计的反相填料,可以为碱性化合物提供良好的峰形。
峰拖尾的三个基本原因:化学问题(其中一个已在前面讨论过);色谱柱填充问题和仪器硬件问题。这三个因素都可能导致峰拖尾,并且必须调查根本原因以确定补救措施。详细讨论这三个问题不在此问题的范围内,但是每种类型的一些示例将为您提供总体思路。首先,除了与硅烷醇的相互作用外,与化学有关的拖尾问题还可以通过几种方式表现出来。金属螯合化合物可与色谱柱填充物中的微量金属发生相互作用,这对于较旧的二氧化硅材料尤为明显。使用错误的注射溶剂有时会导致拖尾。用比流动相强得多的溶剂注入样品会产生峰形失真。拖尾可能是由于色谱柱顶部强烈保留的样品组分或流动相杂质造成的堆积材料引起的。这种材料可以充当不同的固定相,从而导致相互作用的化合物出现拖尾问题。有时会出现混合模式,从而导致拖尾。在这里,溶质可以通过反相和离子相互作用与活性基团相互作用。有时,当流动相的pH值错误并且样品被部分电离时,所产生的峰可能会失真并且类似于拖尾。较大峰背面的部分共溶峰较小,有时看起来像拖尾。
色谱柱填充问题可能导致峰拖尾。色谱柱顶部的空隙会导致双峰或峰拖尾。填料不充分的色谱柱可能会形成通道,导致峰形变差。如果色谱柱因样品质量过大而超载,则可能会出现拖尾现象,尽管峰前沿更为普遍。在低进样质量下,硅烷醇超载可能发生拖尾。
让我们考虑一些可能会拖尾的仪器和硬件问题。拖尾可能是由柱外效应和流路中其他未清扫的体积引起的。末端接头或连接不正确造成的未清除体积可能会显示为峰拖尾。来自进样器的压力脉冲可能会导致色谱柱空隙,从而导致拖尾。缓慢的检测器时间常数和快速洗脱的峰会导致峰展宽,有时类似于拖尾。在室温下进入的溶剂与较高的色谱柱操作温度之间的热不匹配也会导致峰变形。
因此,并非总是硅烷醇在HPLC中引起峰拖尾。

误解3

硅胶填料只能在pH2-7范围内使用

假。通常,HPLC反相色谱柱的化学降解机理有两种:pH值小于2时硅氧烷键的催化水解;液相色谱法。pH值大于7-8的氢氧根离子可溶解硅胶。这两种现象已由Kirkland及其同事进行了广泛研究。在pH值小于2时,–Si-O-Si-(硅氧烷)键可被氢键(H3O +)裂解键合相攻击,从而导致在有机的损失。随着时间的流逝,保留率通常会随着碳含量的降低而降低。对于短链封端部分,例如三甲基硅烷,尤其值得注意。较长的C18相由于其空间位阻而对下面的硅氧烷提供了一定的保护,但最终甚至会受到侵蚀,尤其是在温度高于环境温度的情况下。有空间保护和紧密覆盖的键合相,可帮助阻止键合相在硅胶上的裂解。聚合物相没有显示出这种不稳定性,但是具有比基于二氧化硅的相效率低的缺点。
在高pH值方面,必须有某种方法来阻止下面的硅胶受到氢氧根离子的侵蚀。一旦发生溶解过程,色谱柱最终将失效,经常会形成空隙。特殊色谱柱专为高pH操作而设计,包括二齿C18,杂化和聚合物涂层二氧化硅。这些相从化学上保护基础材料免受氢氧化物的侵蚀。这些填料能够承受11–12范围内的pH值。在此范围内操作时,大多数二氧化硅基填料应避免高温。当然,聚合物相可以在高达13的pH值下操作,有时甚至达到14,但是,它们的缺点是效率低于二氧化硅基相。
因此,真正的答案是:特殊的硅胶键合相可以在pH值为2–7的区间之外操作,但应注意使用常规的硅胶填料,尤其是在高温下。

纳谱分析

ChromCore系列液相色谱柱参数信息表

图片

误解4

现代HPLC色谱柱应承受至少1000次进样

假!有许多因素可控制任何现代HPLC色谱柱可以承受的进样次数。
一些因素基于模式:反相、离子交换、体积排阻、正相、手性、亲水性相互作用等。
其中一些因素取决于色谱柱中填料的类型,例如硅胶填料、杂化填料、氧化锆填料或聚合物填料,或软凝胶或树脂的交联度。
一些因素取决于键合相本身:覆盖范围、键的类型、聚合物相、单层或涂层相。
其他因素取决于操作条件:pH、温度、流动相成分、缓冲液组成、流速、压力等。
还取决于所注入的样品:仅标准样品、样品清洁度、样品pH值、样品体积、样品中存在的杂质、溶质分子本身等。
如果滥用色谱柱,例如在超出其建议的pH限制或流速范围内使用色谱柱,则可能只会进样50次甚至更少。如果样品简单,没有高度保留的杂质,则色谱柱可承受5000次或更多次进样。如果色谱柱未在其上限处连续运行,则使用寿命会更长。如果色谱柱受到各种样品的影响,并且从未冲洗过以去除强烈保留的杂质,那么它将缩短其寿命。
大多数人期望当5 μm反相色谱柱用于分析配方,简单药物混合物和标准品时,至少要进样1000次。如果该色谱柱用于“脏样品",例如尚未*清除的生物液体提取物或环境提取物,则不应期望进行1000次进样。
因此,预期的进样次数不是固定的,而是取决于色谱柱的类型、操作条件、样品清洁度和滥用程度。当然,对于使用保护柱和在线过滤器,色谱柱寿命应更长。许多色谱分析人员实际上并不知道每根色谱柱的使用寿命可获得多少次进样。一些现代的HPLC仪器具有内置的色谱柱模块和软件,可以使它们监测进样次数。

误解5

色谱柱应始终盖紧,以防止填料与大气接触

而损坏

假!通常,端接件上的小孔的直径可能不大于0.02英寸,其横截面面积很小,以至于空气进入填料和溶剂内部的溶剂接触会损坏色谱柱。色谱柱蒸发极少。即使有少量空气进入色谱柱,也可能很难扩散通过微粒填充床并与足够的填充材料接触,从而产生不利影响。如果色谱柱中有少量空气,则在下次将其安装到HPLC仪器中并对其进行泵送流动相后立即对其加压,则少量的空气可能会在高压下溶解或被冲洗掉。初始液体在短时间内不会对以后的使用造成任何问题。但是,如果一定要通过封住端接装置而感到更加安全,那就这样做。大多数色谱柱配备了色谱柱接头,可以拧紧这些螺帽,以防止存储溶剂蒸发或空气进入填充床的任何可能性。



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